高通量測序 鎖定病原體“命門”
病原體能使人類群體性致病甚至致死，為追本溯源，找到變異基因作為有效靶點，科學家們在迎戰(zhàn)埃博拉病毒的過程中取得突破。
《科學》雜志的歷史上，刊載過一篇沉重的學術文章。2014年一篇關于通過基因組學手段監(jiān)測埃博拉病毒的起源和傳播的論文，在刊登時已有6名研究人員因感染埃博拉而死亡。
“對埃博拉病毒的研究和控制是高通量測序技術(二代測序技術)全面應用的首次‘實戰(zhàn)’。”日前，在由中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院主辦的第二屆感染性疾病精準醫(yī)學高峰論壇上，參加過與埃博拉病毒一線作戰(zhàn)的研究人員，對中國團隊與埃博拉病毒“作戰(zhàn)”的戰(zhàn)略戰(zhàn)術進行了揭秘。中國科學院武漢病毒研究所研究員劉翟表示，病原體能使人類群體性致病甚至致死，二代測序技術及宏基因組學能幫助人類追溯病原體、捕捉放大它們在分子水平上的變化、鎖定病原體“命門”，最終贏得“人毒之戰(zhàn)”“人菌之戰(zhàn)”。
測準遺傳物質 新策略抓住病毒“七寸”
在2014西非埃博拉病毒爆發(fā)期間，美國的團隊最初斷言病毒可能在加速進化。劉翟回憶，這一發(fā)現(xiàn)在當時是一個“面臨強敵”的信號，它意味著傳統(tǒng)的檢測防治方法或許失效，如果埃博拉病毒是迅速變化且致命性疊加的致病原，其危險性將比人類最初認知的更高。
“病毒在短時間內迅速變化并不符合進化邏輯。”劉翟說，要改變美國團隊的結論，中國團隊需要提供更多的事實和數(shù)據(jù)。
中國團隊在非期間檢測了大量臨床樣本，對175株埃博拉病毒進行了全基因組測序。“利用二代測序技術，很少的變異也能被‘覺察’到。”劉翟說。
二代測序的應用不是簡單地將病例樣本中的基因提取出來進行比對。全基因組的遺傳信息繁雜而海量，測定不只包括量的疊加，還包括相互作用和影響，即測定病毒在宿主體內的進化，以體現(xiàn)宿主和病毒的基因組之間的相互作用與關聯(lián)。宏基因組學的研究基礎是人和病毒的遺傳物質混在“一個籃子里”，這增加了研究工作難度;此外，由于埃博拉病毒是RNA病毒，共同提取的將是人類遺傳物質中的RNA，RNA的復雜程度也加大了研究難度……
為此，研究團隊設計開發(fā)了埃博拉病毒基因組的新測序策略——擴增子深度測序技術，并開發(fā)了一套全新的生物信息學分析流程。“我們設計了標準質粒進行方法驗證，將測序方法的假陽性率控制在千分之一以下。”劉翟介紹，考慮到在宿主中病毒的痕量，團隊還在方法的敏感性上取得了突破，做到低濃度樣本下仍能探測到位點變化。
團隊對于樣本的生物信息學分析，在病毒暴發(fā)過程中第一次鎖定了埃博拉病毒的“進攻線路圖”。劉翟展示的病毒地理學聯(lián)絡圖，顯示與西非的城市熱度和交通樞紐相一致。
除了進攻路線，團隊還揭示了埃博拉病毒基于自身的“戰(zhàn)術變化”——在宿主內，埃博拉病毒曾經產生了710個單核苷酸變異位點，也維持著最保守基因的不變。保守基因的發(fā)現(xiàn)相當于抓到了病毒的“七寸”。劉翟逆向思維，“最保守基因的突變對于病毒大都有害，可以作為最有效的抗病毒靶點。”
預判威脅 防患SARS“東山再起”
同類技術在SARS(嚴重急性呼吸綜合征)同族病毒的發(fā)現(xiàn)與監(jiān)控中，也發(fā)揮了居功至偉的作用。
幾年前，廣東省四個豬場出現(xiàn)了小豬仔急性腹瀉死亡的疫情，兩萬多頭小豬出生后6天之內迅速死亡。這引起了軍事醫(yī)學科學院研究員童貽剛的注意，“近年來發(fā)生的重大傳染病疫情大部分由動物病毒跨種傳播引起，此次疫情發(fā)生地距離SARS發(fā)源地小于100公里。我們通過遺傳物質的測序確定致病病毒也是一類冠狀病毒。”病毒類型、發(fā)生地點以及近年規(guī)律都不同程度地亮起“警報”。
《變形金剛》里的威震天被消滅多次，卻會在宇宙的盡頭休整，一旦人們放松就伺機重生。SARS冠狀病毒在2003年造成了全球性的恐慌之后，會不會上演威震天的戲碼?
為了回答新發(fā)現(xiàn)病毒與SARS病毒同源性如何、如何傳播、感染人類能力等問題，多個科研機構組成的團隊共同展開研究，基于二代測序技術進行病毒分離鑒定、動物感染回歸實驗、回顧性檢測等工作。團隊將新病毒命名為豬急性腹瀉綜合征(SADS)冠狀病毒。
“通過新舊病毒的比對，我們發(fā)現(xiàn)它與SARS病毒在外殼蛋白上有86%的相似度。”童貽剛說，這說明感染蛋白可能發(fā)生了變化。也就是說，病毒獲準進入機體完成感染的“敲門磚”變了。
隨后，科研團隊用已確定的病毒特征為“釣餌”，在廣東地區(qū)近幾年收集的蝙蝠標本中，尋找是否有蝙蝠攜帶關聯(lián)病毒。在幾百個樣本中，團隊獲得了58份結果為陽性的樣本，大部分來自中華菊頭蝠(注：科學家們此前證實SARS病毒正是來源于中華菊頭蝠)。團隊進行了病毒傳播路線圖的繪制，發(fā)現(xiàn)發(fā)病的4個豬場并沒有相互傳染，很有可能是通過蝙蝠的糞便傳播。
“我們對豬場的飼養(yǎng)員進行了病原體檢測，沒有發(fā)現(xiàn)人員感染。”童貽剛說，但是對于病毒組學的研究表明，該類病毒是有能力感染人類的。病毒對人體的作用，以及激發(fā)人體內的免疫反應和對病毒表達的調控，仍是一個嚴峻課題，有待探索。
初入臨床 顛覆對罕見菌致病性認識
除了在威脅全球的重大傳染病疫情的防控中發(fā)揮重要作用，二代測序技術在日常臨床中的應用將有助于“認新”“控藥”“測毒”等，即診斷新型病原體、確定病毒的抗藥性以防止抗生素濫用、測定不同流行病的源頭等。
“近一年僅我們團隊在診斷病歷中就發(fā)現(xiàn)8例諾卡氏菌病例。而在教科書中，這類菌被描述為罕見菌。”復旦大學附屬中山醫(yī)院感染病科主任胡必杰教授說，過往資料表明，人類對這種菌的致病性認識非常有限。
胡必杰認為，現(xiàn)實與教科書中的反差是由于此前的手段難以幫助醫(yī)生診斷出這種致病菌。“它非常細小，在同樣的培養(yǎng)條件下，很難被分離出來，而且需要7天才會培養(yǎng)到可見。普通培養(yǎng)一般3天。”胡必杰說，菌體的“個性”使得憑經驗在病例中發(fā)現(xiàn)它相對困難。
二代測序技術讓它們重新回到醫(yī)生的診斷“視野”。胡必杰表示，通過對宏基因組進行測序，可無差別地檢測各種病原體，突破了傳統(tǒng)檢測手段的限制，大大提高了病原學檢出的敏感性，這種之前難以被檢出的病原體也“露了餡”。24小時內診斷也能為急性感染的判斷和對癥迅速給出參考。
由于設備要求高、技術門檻高、平臺構建需要大量資金投入，目前在臨床應用領域，二代測序只是“初入”，只有條件好、資金充足的少量三甲醫(yī)院在建相關平臺、培養(yǎng)和儲備技術人員。此外，不同樣本的提取如何才能高效準確、遺傳物質的提取質量標準如何，都尚待完善。中國食品藥品檢定研究院的雙盲測試表明，對于同樣的已知基因，不同測序公司的結果也并非完全一致。
中國工程院副院長、中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院院校長王辰院士呼吁：感染性(傳染性)疾病危害嚴重，精準診斷是實現(xiàn)其精準防控的前提。針對感染這一重大醫(yī)學問題，需要將基因檢測與傳統(tǒng)檢測相結合，加快將最新的生物科技轉化成先進生產力，應用于臨床感染精準診療。(記者 張佳星)
